Obtención de metabolitos secundarios a partir de células madre vegetales

Los productos naturales obtenidos de plantas han sido nuestra principal fuente de medicamentos, insecticidas, tintes, aromas y condimentos. Muchos de los compuestos que han salvado al mundo de enfermedades devastadoras como la malaria (quinina) o ciertos cánceres (vincristina, vinblastina, taxol), son derivados de las plantas. Pero, en los últimos años, las investigaciones en estos productos naturales han sido eclipsados por el desarrollo de técnicas como el tamizaje de alto rendimiento (high throughput screening), el cual se basa en probar – uno por uno – un catálogo de miles de moléculas contra diferentes agentes, ya sean microorganismos, virus, células cancerígenas u otros compuestos químicos.

Sin embargo, hasta ahora no se ha podido igualar la eficiencia de los productos naturales de las plantas, ya que son sus complejas estructuras, difíciles de obtener mediante síntesis orgánica, las responsables de su actividad farmacológica.

Pero, el principal problema es que, por ser metabolitos secundarios, su concentración en las plantas es muy baja y muchas veces se expresan sólo en condiciones especiales, lo cual reduce su rendimiento (cantidad de producto obtenido por planta) y se necesitan extraer más plantas para poder satisfacer la demanda del producto, esto trae consigo la reducción de su población y, posteriormente, su extinción.

Muchos investigadores han desarrollado técnicas de cultivo in vitro de estas plantas, con medios especiales para promover la producción del metabolito secundario deseado, funcionando muy bien a pequeña escala, pero, cuando es llevado a un biorreactor de producción de gran escala, su rendimiento cae considerablemente y la viabilidad de los cultivos se pierde a medida que pasa el tiempo.

Otra estrategia usada es identificar los genes responsables de la síntesis del metabolito secundario deseado, aislarlos e insertarlos en bacterias de fácil cultivo y crecimiento, mediante la ingeniería genética, para que sean las bacterias y no las plantas las encargadas de producir la molécula, o por lo menos un precursor a ella que luego es transformado en el compuesto deseado mediante síntesis orgánica. Sin embargo, la cantidad de enzimas involucradas en la síntesis del producto, así como los factores de transcripción que sólo se encuentran dentro de las células vegetales de donde fueron extraídos, hace que la bacteria sea incapaz de producir el metabolito secundario deseado.

El Taxol®, es quizás la droga más usada en el tratamiento del cáncer. Este fármaco es derivado del paclitaxel, un metabolito secundario obtenido de la corteza del “tejo del pacífico” (Taxus brevifolia). Debido a la sobre-explotación de este árbol, grandes empresas farmacéuticas desarrollaron un método alternativo para producir paclitaxel usando biorreactores. La técnica consistía en cultivar células obtenidas de los embriones y pistilos de diferentes especies de Taxus. Estos medios de cultivo eran especiales porque permitían que estas células pasen a un estado de desdiferenciación (CDD) formando pequeños “callitos”. Luego, estas mezcla de células desdiferenciadas son puestas en biorreactores para producir el metabolito deseado. Sin embargo, este método de producción del paclitaxel tenía varias limitaciones incluyendo una baja tasa de crecimiento, agregación de las células (que dificultaban la producción a gran escala), bajos rendimientos y alta variabilidad en el producto obtenido.

Un gran avance en este campo fue presentado por Lee et al. en la revista Nature Biotechnology. En vez de cultivar una mezcla de células desdiferenciadas, Lee usó células del cambium vascular, que forma parte del meristemo lateral de la planta (célula vegetal de constante crecimiento, capaces de diferenciarse en diferentes tejidos, o sea, similar a una célula madre) y las propagó en un medio de cultivo especial para inducir la formación de callos, tal como en el método anterior.

¿Cómo hizo Lee para extraer estas células?

Primero extrajeron el cambium vascular con todas sus partes (indicados con flechas, en el mismo orden que la figura a): médula (amarillo), xilema (blanco), cambium (verde), floema (rojo), córtex (azul) y epidermis (turquesa). Luego, pelaron cuidadosamente y separaron la médula y el xilema de lo demás.  Luego, cultivaron el cambium, floema, córtex y epidermis en un medio especial para inducir la formación de los callitos. Después de unos días, se ve claramente la división entre las células desdiferenciadas (CDD) del floema, córtex y epidermis (Bottom) de las células indiferenciadas del cambium (Top). Separaron esos dos tipos celulares y se quedaron con las células meristemáticas del cambium (CMC).

Las CMC fueron transferidas a un frasco con medio líquido y observaron que se desagregaron en pequeños grupos de células. Esto es una gran ventaja, porque si recordamos un poco, es la agregación de células la que provoca una caída en el rendimiento del producto en las CDD. Al medir el tamaño de los agregados celulares, en CMC el 95% medía menos de 0.5mm, mientras que en las CDD sólo el 5% eran de este tamaño.

En cuanto al rendimiento de producción se encontraron grandes diferencias. Usando técnicas cuantitativas precisas (HPLC y LC-MS) determinaron que el rendimiento en frascos experimentales (125mL) fue tres veces superior usando las CMCs. Pero, como los lotes de producción son de varios litros, se debía estudiar el comportamiento de las células en mayores volúmenes, donde las fuerzas de cizalla o corte debido a la agitación, son bastante perjudiciales. En un pequeño biorreactor de 3 litros, las CMCs produjeron 100000% (cien mil porciento) más biomasa que las CDDs, y en cuanto al rendimiento de producción en estos tanques de 3 litros, las CMCs produjeron 8 veces más paclitaxel que las CDDs.

Otra gran diferencia fue que las CMCs secretaban al medio de cultivo el 74% del paclitaxel que producían, mientras que las CDDs menos del 5%. Esto es una gran ventaja porque permite reducir los costos de purificación del producto que es lo más caro de todo el proceso.

Aún así, falta mucho por investigar ya que se deben mejorar las células mediante la ingeniería genética y metabólica para aumentar sus rendimientos, de esta manera poder reducir los costos de producción, y por lo tanto, el precio del producto en el mercado. También es importante para conservar estas especies de plantas que se ven amenazadas por la sobre-explotación y es bueno para el ambiente ya que, a diferencia de la síntesis orgánica, no se usan agentes contaminantes y se reduce el uso de solventes orgánicos. Además, este método es fácilmente extrapolable a otras plantas importantes no sólo en la industria farmacéutica, sino también en la producción de pigmentos, insecticidas, aromas para perfumes, etc.

Referencia:

Lee, E., Jin, Y., Park, J., Yoo, Y., Hong, S., Amir, R., Yan, Z., Kwon, E., Elfick, A., Tomlinson, S., Halbritter, F., Waibel, T., Yun, B., & Loake, G. (2010). Cultured cambial meristematic cells as a source of plant natural products Nature Biotechnology, 28 (11), 1213-1217 DOI: 10.1038/nbt.1693